2020年3月24日，中山大學張銳課題組在《自然─結構和分子生物學》（Nature Structural & Molecular Biology）雜志發表題為“irCLASH reveals RNA substrates recognized by human ADARs”的研究論文錛特聘副研究員宋玉龍博士及博士生楊文兵為該論文的並列第一作者。該研究開發了一個高效的捕獲特定RNA結合蛋白雙鏈RNA底物的建庫測序技術（irCLASH）以及後續的一整套生物信息學分析方法。 基于該方法，

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作者對人類RNA編輯核心蛋白ADAR的細胞內雙鏈RNA底物進行檢測，首次在轉錄組水平上系統地繪制了ADAR蛋白的內源雙鏈RNA底物圖譜。 通過對ADAR雙鏈RNA底物進行系統的生物信息學分析及實驗驗證，作者揭示了決定ADAR結合效率和編輯效率的底物特征和ADAR結合長雙鏈RNA的體內模型。 ADAR蛋白家族能結合到特定RNA的雙鏈區域，並催化A堿基發生脫氨基反應生成I堿基，導致A-to-I RNA編輯。 A-to-I RNA編輯是動物中最普遍的RNA編輯類型，廣泛的參與轉錄水平和轉錄後水平的多種基因調控機制，比如在轉錄組水平改變氨基酸序列，調控mRNA剪切、mRNA穩定性和環狀RNA形成等等。 在哺乳動物細胞中，ADAR蛋白家族含有三個成員：ADAR1、ADAR2及ADAR3，它們在多器官發育、大腦功能中發揮重要的功能。最近的研究表明ADAR1介導的非編碼區域RNA編輯可用于標記“自我”和“非我”RNA，在先天免疫系統中起了重要的負調控作用。但是具體哪些ADAR的RNA底物是最關鍵的可以調控免疫反應的天然底物還不知道。抑制ADAR1的編輯活性可以極大的促進腫瘤免疫療法的效果，因此ADAR1可以作為腫瘤免疫療法的重要靶標。 此外，目前針對特定位點突變導致的疾病主要從基因組水平修復。比如CRISPR/Cas9系統直接從基因組水平修復突變位點，但這一系統在DNA和RNA水平都有脫靶效應，

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並且Cas9蛋白本身會刺激細胞免疫反應，

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這些都限制了其臨床應用。 相比于DNA編輯，定點RNA編輯具有可控和可逆性，不影響基因組穩定性，

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並且可以只導入RNA而非蛋白，不會誘導免疫反應，在臨床上具有一系列優勢。 目前已有多個研究利用特定的導向RNA招募ADAR蛋白進行定點RNA編輯，但是這一領域最大的問題之一是RNA編輯效率低。揭示內源ADAR如何有效地識別和編輯底物可以用于指導和優化RNA靶向編輯系統。 盡管刻畫ADAR蛋白的內源RNA底物具有重要的意義，但由于技術的局限性，目前研究人員對ADAR內源底物的特性及A-to-IRNA編輯的強度如何通過雙鏈RNA的結構和堿基組成精細的調控所知甚少。 基于CLASH (crosslinking錛 ligation錛 andsequencing of hybrids) 的原理，作者通過TSAP□和T4 PNK的組合使用以及新型接頭的使用，提高了RNA分子間的連接效率和雙鏈RNA底物的得率，使得研究人員可以在2天內完成整個irCLASH的建庫流程（圖1）。 同時，針對在建庫過程中，雙鏈RNA的兩條序列的連接具有雙向性的特點，作者開發了相應的分析流程，進一步提高了雙鏈RNA底物的得率。另外，作者利用ADAR的雙鏈RNA和單鏈底物進行組裝拼接，進而得到了完整的、全長雙鏈RNA底物。 圖1：irCLASH的建庫流程。 與之前根據計算推導的研究設想不同，作者發現ADAR具有大量的、長距離的雙鏈RNA底物。作者還發現不完全互補配對的底物跟ADAR蛋白也有很好的親和度，特別是ADAR2家族成員。一般來說，一個底物雙臂之間的距離越長，其底物的雙鏈結合區域就越長，但是雙臂的距離長度跟底物的配對程度沒有太大的相關性。 通過對全轉錄組水平ADAR底物的一系列生物信息學分析及實驗驗證，作者進一步揭示了決定ADAR結合效率和編輯效率的底物特征。 最後，作者意外地發現ADAR蛋白能夠串聯結合于雙鏈RNA底物上，

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並且相鄰兩個蛋白分子間大約間隔50bp，

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通過這種串聯結合可以提高其RNA底物的編輯效率。 基于上述發現，作者提出了一個ADAR結合長雙鏈RNA的協同結合模型，這一模型為長雙鏈RNA編輯效率較高這一現象提供了一個可能的分子水平的解釋（圖2）。 圖2：ADAR結合和編輯長雙鏈RNA底物的3種可能模型。其中模型C（協同結合模型），符合我們全轉錄組ADAR底物分析結果。 總而言之，作者通過開發irCLASH測序技術及後續的整套生物信息學分析方法為研究雙鏈RNA結合蛋白的內源底物提供了新的工具。 利用這一工具，作者捕獲和刻畫了RNA編輯核心蛋白ADAR家族每個成員的內源雙鏈RNA底物，揭示了決定RNA編輯位置和強度的特征，為研究ADAR的功能、調控機制等後續研究提供了基礎。 同時，該研究揭示的ADAR與底物相互作用及催化特性為研究人員開發高效的RNA定點編輯工具提供了資源寶庫及改進方向。 論文信息：DOI：10.1038/s41594-020-0398-4A Tetratricopeptide Repeat Protein Regulates Carotenoid Biosynthesis and Chromoplast Development in Monkeyflower (Mimulus)First author: Lauren E Stanley; Affiliations: University of Connecticut (康涅狄格大學): Storrs錛 USACorresponding author: Yao-Wu YuanLittle is known about the factors regulating carotenoid biosynthesis in flowers. Here錛 we characterize the Reduced Carotenoid Pigmentation 2 (RCP2) locus from two monkeyflower (Mimulus) species錛 the bumblebee-pollinated M. lewisii and hummingbird-pollinated M. verbenaceus. We show that loss-of-function mutations of RCP2 cause drastic down-regulation of the entire carotenoid biosynthetic pathway. We have identified the causal gene underlying RCP2錛 encoding a tetratricopeptide repeat (TPR) protein that is closely related to the Arabidopsis Reduced Chloroplast Coverage (REC) proteins. RCP2 appears to regulate carotenoid biosynthesis independently of RCP1錛 a previously identified R2R3-MYB master regulator of carotenoid biosynthesis. We show that RCP2 is necessary and sufficient for chromoplast development and carotenoid accumulation in floral tissues. Simultaneous down-regulation of RCP2 and two closely related paralogs錛 RCP2-L1 and RCP2-L2錛 produces pale leaves deficient in chlorophyll and carotenoid content and with reduced chloroplast compartment size. Finally錛 we demonstrate that M. verbenaceus is just as amenable to chemical mutagenesis and in planta transformation as the more extensively studied M. lewisii錛 making these two species an excellent platform for comparative developmental genetics studies of closely related species with dramatic phenotypic divergence.目前，我們對于花中調控類胡蘿卜素合成的分子機制了解不多。本文中，作者從兩個猴面花物種（一個是由熊蜂授粉的Mimulus lewisii，另一個是由蜂鳥授粉的Mimulus verbenaceus）中鑑定到了一個作用于類胡蘿卜素色素減少的位點RCP2。作者發現RCP2的功能缺失突變體會導致整個類胡蘿卜素生物合成通路的劇烈下調。作者鑑定到了RCP2位點所編碼的基因，是一個編碼四□重復TPR蛋白的基因，與擬南芥的REC蛋白近緣。RCP2蛋白能夠獨立于RCP1發揮調控類胡蘿卜素生物合成的作用，其中RCP1蛋白是作者在2015年鑑定到的一個調控類胡蘿卜素合成的主要調控因子，屬于R2R3-MYB轉錄因子（Sagawa et al.錛 2015錛 New Phytologist）。作者發現RCP2對于花組織中的質體發育以及類胡蘿卜素積累是必要且充分的。同時下調RCP2以及兩個旁系同源基因RCP2-L1和RCP2-L2的表達，

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能夠獲得白色的葉片，其中葉綠素和類胡蘿卜素含量存在缺陷，且葉綠體的區室明顯減小。最終，作者揭示了M. verbenaceus具有與M. lewisii一樣便于化學誘變以及遺傳轉化，使得這對物種成為了具有明顯表型分化的近緣物種比較發育遺傳研究的理想平台。p.s. 植物中的色素主要有三類：類黃酮（flavonoid）、甜菜素（betalain）和類胡蘿卜素（carotenoid）。其中，甜菜素僅在石竹目（Caryophyllale）中有發現，而另外兩種則在植物界廣泛分布。其中，以類黃酮的研究最為深入，其也具有最廣的顏色範圍。類黃酮色素中的花青素（anthocyanin）在胞質中合成，定位于液泡，並且是水溶性，具有從橙色到藍色的顏色跨度，作用于許多植物花器官的顏色色素沉著。而類胡蘿卜素則是具有多烯鏈的類異戊二烯化合物（主要為C40），主要顏色為淡黃色或從橙色到紅色。類胡蘿卜素在植物中具有非常重要的作用，參與植物的色素沉著、光保護以及脫落酸和獨腳金內酯的合成，同時對于人類的日常飲食、營養和健康也非常重要。通訊：袁耀武 (https://monkeyflower.uconn.edu)個人簡介：2000-2004年，四川大學，學士；2004-2008年，華盛頓大學，博士；2009-2010年，佐治亞大學，博士後。研究方向：以猴面花對象研究花的多樣化，從而窺探植物的表型演化。doi: https://doi.org/10.1105/tpc.19.00755Journal: Plant CellPublished date: March 04錛 2020p.s. 相關研究鏈接Current Biology：猴面花花瓣斑點形成的分子機制Plant Cell：PC推薦～WP1調控苜蓿花瓣中的類胡蘿卜素積累，